易基因|植物靶基因DNA甲基化研究超級問答:想知道的都在這裡

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DNA甲基化在植物基因組中以CG、CHG和CHH三種堿基序列的胞嘧啶上發生(H=A,T或C),甲基化轉移酶包括DRM,CMT和MET等。在植物中,DNA胞嘧啶的甲基化會導致基因表達的改變和轉座因子的失活,修飾狀態的改變可能產生具有不同表型狀態的表觀等位基因。

近期不少老師咨詢植物能不能做靶基因(單個或幾個目標基因)DNA甲基化測序,易基因小編連夜奮筆疾書,將老師最關心的植物靶基因甲基化問題進行整理,最全面的解答來咯。

Q:DNA 甲基化在植物中的作用

A:DNA甲基化是生物體中非常重要的調控模式,在基因表達、轉座子沉默、染色質相互作用、細胞分化以及生長發育過程中起著重要作用。植物DNA甲基化模式的改變不僅可以影響植物的花期、育性、花以及葉的形態等生命活動,而且在植物印記、逆境脅迫和雜種優勢等方面也發揮著一定的作用。

Q:植物DNA甲基化測序方法有哪些?

A:植物DNA甲基化測序方法通常用的是全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS),包括常規WGBS、微量樣本WGBS(Micro DNA-BS)、單細胞scWGBS,另外還有植物簡化基因組甲基化測序(Plant-RRBS)和免疫共沉淀測序(MeDIP-seq),適用於不同研究需求。

Q:植物能做靶基因的DNA甲基化檢測嗎?

A:植物基因組中CG、CHG和CHH等單個C堿基都有甲基化。目前主要的研究方法還是以植物整個區域亞硫酸鹽測序為主,單基因甲基化沒有很好的方法,前期探索研究可用MSP方法(特異性甲基化PCR)。雖然有個別文章通過BSP測序檢測單基因甲基化,但不是非常建議,如果物種基因組不大,直接全基因組甲基化測序就可以,無論是成本還是準確性都更優,沒必要檢測單個基因。

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圖:靶基因甲基化測序技術原理

Q:植物靶基因甲基化按照目標基因設計特異引物進行PCR擴增是否為一種可行性方法?

A:首先,不確定單個C是否甲基化,如果未被甲基化,亞硫酸鹽轉化會將其變為U,甲基化保持C堿基不變。

其次,引物裡如果有C堿基,無法確定設計成C堿基或T堿基。隻有在上下遊引物都不含C或隻含1-2個C,單條引物把各種可能性都納入考慮,確保上下遊引物不含C堿基。舉例說明,引物裡有2個C,那1條引物的排列組合就是CC/TC/CT/TT四種。

此外,如果區域較大,基因引物設計需要考慮各種組合。不僅花費大量的時間,還不一定能有效擴增出產物。特別是甲基化轉化後PCR自身就很難擴。如果甲基化模式隻發生在CG島,單基因或多基因都可以做。但植物DNA甲基化可以同時在CG、CHG和CHH都存在,主要受CHH等甲基化模式的影響。

Q:植物全基因組甲基化測序能避免靶基因甲基化引物設計的問題?

A:全基因組甲基化測序技術是通過T4-DNA連接酶,在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列,連接產物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉變為尿嘧啶U,進而通過接頭序列介導的 PCR 技術將尿嘧啶U轉變為胸腺嘧啶T。

全基因組甲基化測序並非通過基因組序列進行擴增,因而完全可以避免靶基因甲基化引物設計中遇到的問題。

Q:想瞭解植物目標基因的甲基化水平,應該怎麼做?

A:現有測序技術首選還是全基因組甲基化測序。

技術層面,全基因組甲基化測序可以在全基因組范圍內精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基(C堿基)的甲基化水平,是DNA甲基化研究的金標準。

價格層面,隻PCR擴增,單個PCR產物約300元左右(測序讀長是300),基因組PCR設計(引物設計合成)5000bp約1000-2000元/樣本,加上後續的建庫、測序、分析費用,價格不低。而同等測序數據量的全基因組甲基化從樣本提取到建庫測序分析全套價格並不比靶基因甲基化測序高。

研究成果方面,植物靶基因甲基化在引物設計PCR擴增中不一定能擴增出產物。即使能擴增出產物,如果引物設計不當,研究出的結果也極有可能不被認可。因為存在選擇性擴增的問題,哪怕在引物設計時把所有排列組合都考慮到,擴增時還是會優先擴增某種組合的引物。最後要麼沒有結果,要麼結果不被認可。

綜上所述,植物全基因組DNA甲基化是一種更有效、更直接、更省錢的技術。

Q:預算有限時,植物的DNA甲基化研究方法推介?

A:全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)是植物甲基化檢測金標準。如果預算有限,可以考慮植物簡化基因組甲基化測序,易基因研究團隊創建的雙酶切DRRBS(Plant-RRBS)被同行研究證明,對於大基因組或植物群體基因組甲基化的檢測極為有效,胞嘧啶覆蓋廣泛。

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